今天百螢為大家介紹一下關(guān)于ELISA的小知識(shí)，什么是ELISA？ELISA的檢測(cè)方法有哪些？?jī)?yōu)缺點(diǎn)是什么？*好用的ELISA檢測(cè)試劑/試劑盒是什么？感興趣的朋友一起來(lái)看看吧！
酶聯(lián)**吸附測(cè)定法（ELISA）是一種使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定的**測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量生物分子，例如抗體、蛋白質(zhì)、**或肽，以及表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。在ELISA中，將用于實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)（通常是抗原）固定在固體表面上，然后用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)與被酶催化的底物孵育來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，從而產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。
酶聯(lián)**吸附測(cè)定（ELISA）概述
ELISA測(cè)定法通常在96孔板中進(jìn)行。這些板被設(shè)計(jì)成通常通過(guò)直接吸附到微量滴定板的表面上或間接地通過(guò)預(yù)先包被的抗體間接地結(jié)合和固定抗原。固定后，將一抗引入樣品中，與抗原形成**復(fù)合物。一抗可以共價(jià)標(biāo)記到酶（例如HRP）上，或者如果一抗被生物素標(biāo)記，則一抗本身可以使用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體或鏈霉親和素偶聯(lián)物間接檢測(cè)。通過(guò)與合適的底物孵育來(lái)評(píng)估共軛酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，該底物會(huì)產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。試劑盒在靈敏度和成像設(shè)備的兼容性方面各不相同。
直接與間接檢測(cè)
在ELISA中檢測(cè)**抗體-抗原復(fù)合物的方法可以是直接的或間接的（圖1）。在直接檢測(cè)方法中，與報(bào)告酶（例如HRP或AP）綴合的單一一抗可以直接檢測(cè)靶抗原。通過(guò)間接檢測(cè)，可以依次使用雙抗體系統(tǒng)檢測(cè)目標(biāo)靶標(biāo)。首先，將樣品與針對(duì)目標(biāo)抗原的未標(biāo)記一抗孵育。然后，使用一抗特異的酶標(biāo)二抗檢測(cè)其存在，從而檢測(cè)靶抗原。如果使用生物素化的一抗檢測(cè)抗原，則使用酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素偶聯(lián)物作為您的**檢測(cè)試劑。
使用哪種檢測(cè)方法取決于靶抗原的表達(dá)水平。為了檢測(cè)高度表達(dá)的抗原，直接檢測(cè)是合適的方法。當(dāng)靈敏度至關(guān)重要時(shí)，例如檢測(cè)低豐度靶標(biāo)或表達(dá)**的抗原，請(qǐng)使用間接檢測(cè)方法來(lái)增強(qiáng)信號(hào)。
圖1.使用靶標(biāo)特異性抗體進(jìn)行直接和間接抗原檢測(cè)的圖示。
ELISA的三種檢測(cè)方法
1.直接法
在直接ELISA中，抗原通過(guò)被動(dòng)吸附直接固定在板的表面，并使用HRP標(biāo)記的一抗進(jìn)行檢測(cè)。將無(wú)色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號(hào)產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。在所有ELISA法中，直接ELISA分析*簡(jiǎn)單，執(zhí)行*快，但靈敏度*低。
方案：比色直接ELISA
-
用檢測(cè)抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過(guò)夜
-
去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
-
在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時(shí)
-
用緩沖液洗板3次
-
與HRP標(biāo)記的一抗在室溫下孵育1小時(shí)
-
用緩沖液洗板4次
-
在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液（#11012）接種板15-30分鐘。
-
使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液（#11020）停止反應(yīng)
-
用ELISA酶標(biāo)儀測(cè)量650 nm處的吸光度信號(hào)
|
圖2：直接ELISA圖解。
|
|
直接ELISA檢測(cè)
|
|
優(yōu)點(diǎn)
|
-
簡(jiǎn)單快捷，需要更少的試劑和更少的步驟
-
消除了二抗的交叉反應(yīng)
|
|
缺點(diǎn)
|
-
抗原固定不明確會(huì)導(dǎo)致潛在的高背景干擾
-
一抗必須單獨(dú)標(biāo)記，這既費(fèi)時(shí)又昂貴
-
酶對(duì)一抗偶聯(lián)物的**反應(yīng)性可能會(huì)產(chǎn)生不利影響
-
柔韌性低，因?yàn)楸仨毰悸?lián)一抗
-
無(wú)信號(hào)放大
|
2.間接法
間接ELISA本質(zhì)上是直接ELISA的修改版本。在間接ELISA中，用于檢測(cè)抗原的一抗是未偶聯(lián)的。取而代之的是，對(duì)一抗的宿主物種具有反應(yīng)性的酶標(biāo)二級(jí)抗體被用于檢測(cè)一抗-抗原復(fù)合物（間接檢測(cè)抗原）。將無(wú)色底物引入樣品，該底物與酶結(jié)合物反應(yīng)，并產(chǎn)生可測(cè)量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學(xué)發(fā)光的或熒光的。信號(hào)產(chǎn)生的大小與樣品中抗原的數(shù)量成正比。與直接ELISA相比，使用輔助檢測(cè)試劑具有明顯的優(yōu)勢(shì)，即信號(hào)放大。
方案：比色間接ELISA
-
用檢測(cè)抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過(guò)夜
-
去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
-
在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時(shí)
-
用緩沖液洗板2次
-
與未偶聯(lián)的一抗在室溫下孵育1小時(shí)
-
用緩沖液洗板4次
-
在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗（在封閉緩沖液中）孵育1小時(shí)
-
用緩沖液洗板4次
-
在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液（#11012）接種板15-30分鐘。
-
使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液（#11020）停止反應(yīng)
-
用ELISA酶標(biāo)儀測(cè)量650 nm處的吸光度信號(hào)
|
圖3：間接ELISA圖解。
|
|
間接ELISA檢測(cè)
|
|
優(yōu)點(diǎn)
|
-
方便-多種預(yù)標(biāo)記的二抗可商購(gòu)
-
經(jīng)濟(jì)–需要更少的標(biāo)記抗體
-
高度敏感–一抗包含多種表位，可結(jié)合幾種標(biāo)記的二抗，導(dǎo)致信號(hào)放大
-
非常靈活–單個(gè)二抗可用于檢測(cè)不同的一抗
-
保留一抗的*大**反應(yīng)性
-
相同的一抗（例如生物素/鏈霉親和素）可以使用不同的可視化標(biāo)記
|
|
缺點(diǎn)
|
-
來(lái)自二抗的潛在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性染色
-
與直接ELISA相比更長(zhǎng)的操作流程需要額外的孵育步驟
|
3.夾心法
夾心ELISA分析是*常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗體對(duì)，從而每種抗體對(duì)抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱(chēng)為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進(jìn)靶抗原的固定。然后，**種抗體（稱(chēng)為檢測(cè)抗體）與捕獲抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。*后，添加對(duì)檢測(cè)抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標(biāo)記的**抗體偶聯(lián)物。
方案：比色夾心ELISA
-
用捕獲抗體，密封板包被PCV微量滴定板的孔，并在4°C下孵育過(guò)夜
-
去除染料溶液并用所需的緩沖液洗板2次
-
在4°C下用所需的封閉溶液封閉板1小時(shí)
-
用所需緩沖液洗板2次
-
向每個(gè)孔中添加樣品，在37°C下孵育2小時(shí)
-
取出樣品并用所需緩沖液洗板2次
-
與未偶聯(lián)的檢測(cè)抗體在室溫下孵育1小時(shí)
-
用所需緩沖液洗板4次
-
在室溫下與HRP標(biāo)記的二抗（在封閉緩沖液中）孵育1小時(shí)
-
用所需緩沖液洗板4次
-
在室溫下用ReadiUse TMB底物溶液（貨號(hào)11012）接種板15-30分鐘。
-
使用Signal Guard HRP反應(yīng)停止溶液（目錄號(hào)11020）停止反應(yīng)
-
用ELISA酶標(biāo)儀測(cè)量650 nm處的吸光度信號(hào)
|
圖4：夾心ELISA圖解。
|
|
夾心ELISA檢測(cè)
|
|
優(yōu)點(diǎn)
|
-
高靈敏度–靈敏度比直接或間接ELISA形式高2至5倍
-
非常靈活–直接和間接檢測(cè)均可使用
-
高特異性–由于使用了匹配的抗體對(duì)，因此可以特異性地捕獲和檢測(cè)抗原
-
適用于復(fù)雜，粗略或不純的樣品–抗原無(wú)需在測(cè)量前純化
|
|
缺點(diǎn)
|
-
優(yōu)化匹配抗體對(duì)可能很困難–捕獲和檢測(cè)抗體可能會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)
|
通用ELISA測(cè)定試劑盒
|
貨號(hào)
|
產(chǎn)品名稱(chēng)
|
Ex（nm）
|
Em（nm）
|
規(guī)格
|
價(jià)格
|
|
11540
|
Amplite 熒光法羊抗鼠IgG-HRP偶聯(lián)物ELISA檢測(cè)試劑盒 紅色熒光
|
571
|
585
|
1000 Tests
|
2460
|
|
11541
|
Amplite 熒光法羊抗兔IgG-HRP偶聯(lián)物ELISA檢測(cè)試劑盒 紅色熒光
|
571
|
585
|
1000 Tests
|
2460
|
|
36370
|
Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法*
|
650
|
|
1 plate
|
3720
|
|
36371
|
Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*比色ELISA法*
|
650
|
|
10 plate
|
24576
|
|
36373
|
Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光ELISA法*
|
571
|
585
|
1 plate
|
3720
|
|
36374
|
Screen Quest cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光ELISA法*
|
571
|
585
|
10 plate
|
24576
|
|
36379
|
Screen Quest 免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*
|
390
|
650
|
1 plate
|
6240
|
|
36380
|
Screen Quest 免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*
|
390
|
650
|
10 plate
|
10716
|
|
36381
|
Screen Quest 免洗cAMP檢測(cè)試劑盒*熒光能量共振轉(zhuǎn)移法*
|
390
|
650
|
50 plate
|
44100
|
百螢生物是美國(guó)AAT Bioquest中國(guó)區(qū)域代理商，為您提供AAT Bioquest*上等的產(chǎn)品、*詳盡的技術(shù)和*前沿的資訊，歡迎來(lái)電咨詢！