PCR法檢測(cè)新冠等病毒DNA/RNA的熒光探針

今天，百螢為大家介紹使用PCR來對(duì)病毒DNA/RNA進(jìn)行標(biāo)記、定量、檢測(cè)的熒光探針。在臨床分子診斷中，核酸擴(kuò)增檢測(cè)法，例如“逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）”可以用來早期檢測(cè)和鑒定由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的傳染病。RT-PCR以mRNA為起始模板，可在體外快速轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)。核酸檢測(cè)已成功用于檢測(cè)大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括流感病毒，腸病毒，冠狀病毒，埃博拉病毒和HIV。

逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是檢測(cè)和定量mRNA表達(dá)水平的高度靈敏技術(shù)。在RT-PCR中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。然后使用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序（變性，退火和延伸）將cDNA用作擴(kuò)增模板。RT-PCR可用于多種應(yīng)用，包括基因表達(dá)分析，微陣列，病原體檢測(cè)和**研究。

表1.RNA定量試劑/試劑盒

RT-PCR定量方法及產(chǎn)品

RT-PCR產(chǎn)物的定量方法通常可分為兩類：終點(diǎn)RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR。終點(diǎn)RT-PCR常用來測(cè)量少量樣品中的基因表達(dá)變化，而實(shí)時(shí)RT-PCR已成為在全球范圍內(nèi)驗(yàn)證基因表達(dá)變化的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.終點(diǎn)RT-PCR

終點(diǎn)RT-PCR是在完成*后一個(gè)PCR循環(huán)后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行的分析。 用于定量終點(diǎn)RT-PCR的通用測(cè)量方法要求通過使用熒光染料（例如溴化乙錠EB）或P32標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的定量來檢測(cè)基因表達(dá)水平。 終點(diǎn)RT-PCR可用于通過三種不同方法測(cè)量表達(dá)水平的變化：相對(duì)，競(jìng)爭(zhēng)和比較。

表2.終點(diǎn)RT-PCR檢測(cè)方法

2.實(shí)時(shí)RT-PCR

實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）使用熒光報(bào)告分子來可靠地檢測(cè)在PCR過程的每個(gè)循環(huán)中生成的產(chǎn)物。（隨著反應(yīng)的進(jìn)行，由于每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中PCR產(chǎn)物的積累，熒光增加。）。這些熒光報(bào)告分子包括結(jié)合到雙鏈DNA的染料（例如Cyber Green ）或序列特異性探針（例如Molecular Beacons）。

2.1使用DNA結(jié)合染料的非特異性檢測(cè)

在實(shí)時(shí)PCR中，DNA結(jié)合染料被用作熒光報(bào)告基因，以實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR反應(yīng)。隨著產(chǎn)物在每個(gè)連續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中的積累，報(bào)告染料的熒光增強(qiáng)。記錄每個(gè)循環(huán)的熒光發(fā)射量，可以檢測(cè)指數(shù)期的PCR反應(yīng)。 Cyber Green 是一種敏感的雙鏈DNA特異性染料，針對(duì)實(shí)時(shí)RT-PCR進(jìn)行了優(yōu)化。在溶液中，未與DNA結(jié)合的染料幾乎沒有熒光。當(dāng)染料與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光會(huì)大大增強(qiáng)。與市面常見的SYBR Green相比，Cyber Green一般較少抑制RT-PCR也不太可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。Cyber Green可以在更高的染料濃度高中，產(chǎn)生更強(qiáng)的PCR信號(hào)。較高的Cyber Green濃度允許用于qPCR消除“染料再分配”的問題。盡管雙鏈DNA結(jié)合染料為實(shí)時(shí)PCR提供了*方便，*便宜的選擇，但它有一個(gè)很明顯的缺點(diǎn)是特異性和非特異性產(chǎn)物均會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。

表3.DNA結(jié)合染料

2.2使用目標(biāo)特異性FRET探針進(jìn)行特異性檢測(cè)

分子信標(biāo)是一個(gè)單鏈寡核苷酸序列，用兩個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記，并保持“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。在目標(biāo)序列的存在下，它們會(huì)展開、結(jié)合并發(fā)出熒光。分子信標(biāo)由四部分組成：

• Loop：由與靶序列互補(bǔ)的分子信標(biāo)的18-30個(gè)堿基對(duì)區(qū)域組成。
• Stem：在環(huán)的兩個(gè)末端連接的是兩個(gè)相互互補(bǔ)的（5至7個(gè)核苷酸殘基）短寡核苷酸。
• 5'末端熒光團(tuán)：在分子信標(biāo)的5'末端共價(jià)連接有熒光染料。
• 3'末端淬滅劑：在分子信標(biāo)的3'末端共價(jià)連接了一個(gè)非熒光猝滅劑。

2.2.1 Tide Fluor 寡核苷酸標(biāo)記系列產(chǎn)品

Tide Fluor 染料經(jīng)過優(yōu)化，可用于FRET寡核苷酸和肽標(biāo)記。我們的Tide Fluor 染料比香豆素，熒光素，羅丹明和花青等經(jīng)典標(biāo)記染料具有更強(qiáng)的熒光性和更高的光穩(wěn)定性。它們是在不降低性能的情況下標(biāo)記肽和寡核苷酸的*佳熒光染料。

表4.經(jīng)典熒光標(biāo)記染料

表5.Tide Fluor 染料和光譜性質(zhì)

1. ε= *大吸收波長(zhǎng)處的消光系數(shù)（cm ^-1 M ^-1）
2. Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率
3. 260 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對(duì)260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標(biāo)記）
4. 280 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對(duì)280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質(zhì)標(biāo)記）

2.2.2 Tide Quencher 淬滅劑系列產(chǎn)品

DABCYL是用于開發(fā)各種FRET應(yīng)用的染料，但對(duì)于較長(zhǎng)波長(zhǎng)的染料（例如熒光素，羅丹明和花青）的低淬滅效率限制了其在敏感的熒光FRET探針開發(fā)中的應(yīng)用，另外，DABCYL的吸收光譜對(duì)環(huán)境比較敏感。AAT Bioquest已開發(fā)出耐用的Tide Quencher 系列產(chǎn)品，用于開發(fā)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的FRET探針。Tide Quencher 染料是消除經(jīng)典淬滅劑限制的**選擇。

Tide Quencher 染料的主要優(yōu)點(diǎn)：

• 探索其他淬滅劑無法實(shí)現(xiàn)的FRET應(yīng)用。
• 多種反應(yīng)形式便于自我構(gòu)建所需的FRET生物分子。
• 與所需的熒光供體完全匹配。
• 更低的價(jià)格和更好的性能。

表6.Tide Quencher 染料和光譜性質(zhì)

2.2.3 Covidyte 肽底物系列產(chǎn)品

Covidyte系列產(chǎn)品是AAT Bioquest針對(duì)COVID-19*新研發(fā)的肽底物，用于通過FRET檢測(cè)冠狀病毒蛋白酶的強(qiáng)度。該系列產(chǎn)品為尋找冠狀病毒蛋白酶抑制劑提供了高靈敏的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

表7.Covidyte 肽底物

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