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DiA (22030)
DiD (22033, 22051, 22054, 22056)
DiO (22038, 22039, 22040, 22042, 22045, 22046, 22066)
DiI (22035, 22044, 22050, 22052, 22101, 22102, 22103)
DiR (22070) DiS (22073, 22076)
儲(chǔ)存條件：-20℃防潮避光
簡(jiǎn)介
DiA，DiI，DiO，DiD和DiR染料是用于標(biāo)記細(xì)胞膜和其他疏水結(jié)構(gòu)的親脂性熒光染料家族。當(dāng)摻入膜中或與親脂性生物分子如蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，這些對(duì)環(huán)境敏感的染料的熒光大大增強(qiáng)，盡管它們?cè)谒惺侨鯚晒獾?。它們具有高消光系?shù)，極性依賴性熒光和短激發(fā)態(tài)壽命。一旦應(yīng)用于細(xì)胞，這些染料在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)橫向擴(kuò)散，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞以其**濃度均勻染色。 DiI（橙色熒光），DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和DiR（深紅色熒光）的獨(dú)特?zé)晒忸伾珵榛罴?xì)胞的多色成像和流式細(xì)胞分析提供了便利的工具。 DiO和DiI可分別與標(biāo)準(zhǔn)FITC和TRITC過濾器一起使用。其中DiD受633 nm He-Ne激光器的激發(fā)，并且具有比DiI更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，為標(biāo)記具有顯著內(nèi)在熒光的細(xì)胞和組織提供了有價(jià)值的替代方案。 DiR可能對(duì)體內(nèi)成像或追蹤有用，因?yàn)榧t外光通過細(xì)胞和組織的有效傳播和低水平的紅外線范圍內(nèi)的自發(fā)熒光。
物理化學(xué)特性
樣本操作步驟
1.準(zhǔn)備DiO，DiI DiD，DiS或DiR膜染色溶液：
1.1制備DMSO或EtOH儲(chǔ)備溶液：儲(chǔ)備溶液應(yīng)在DMSO或EtOH中以1-5mM制備。
注意：儲(chǔ)備溶液的未使用部分應(yīng)儲(chǔ)存在-20 oC。 避免反復(fù)凍/融循環(huán)。
1.2準(zhǔn)備工作溶液：將儲(chǔ)備溶液（步驟1.1）稀釋到合適的緩沖液中，如無血清
培養(yǎng)基，HBSS或PBS制備1至5μM的工作溶液。
注意：對(duì)于不同的細(xì)胞類型和/或?qū)嶒?yàn)條件，應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定工作溶液的濃度。 建議在至少超過十倍范圍的濃度下進(jìn)行測(cè)試。
2.將細(xì)胞染成懸浮液：
2.1在染料工作溶液中懸浮細(xì)胞密度為1×106 / mL（來自步驟1.2）。
2.2在37°C孵育2-20分鐘。 孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。 首先孵育20分鐘，然后根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化以獲得均勻的標(biāo)記。
2.3將標(biāo)記的懸浮管以1000至1500rpm離心5分鐘。
2.4取出上清液，輕輕地將細(xì)胞重新懸浮在預(yù)熱（37°C）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
2.5按步驟2.3和2.4洗滌兩次。
3.染色貼壁細(xì)胞：
3.1在無菌玻璃蓋玻片上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。
3.2從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中取出蓋玻片，輕輕地排出多余的培養(yǎng)基。 將蓋玻片放在濕度箱中。
3.3將100μL染料工作溶液（來自步驟1.2）吸移到蓋玻片的角落，輕輕攪拌直至所有細(xì)胞都被覆蓋。
3.4將蓋玻片在37°C孵育2-20分鐘。 孵育時(shí)間取決于細(xì)胞類型。 首先孵育20分鐘，然后根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化以獲得均勻的標(biāo)記。
3.5排出染料工作溶液，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基清洗蓋玻片兩到三次。對(duì)于每個(gè)洗滌循環(huán)，用預(yù)熱的生長(zhǎng)培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，孵育5-10分鐘，然后排出培養(yǎng)基。
4.顯微鏡檢測(cè)：
4.1表1總結(jié)了DiD，DiO，DiI，DiS和DiR濾波器組的選擇。
4.2為了同時(shí)檢測(cè)多種染料，可提供如下多波段濾波器組：
a）DiI和DiO = Omega XF52，Chroma 51004
b）DiI和DiD = Omega XF92，Chroma 51007
c）DiI，DiO和DiD = Omega XF93，Chroma 61005
5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：
用DiO，DiI，DiD，DiS和DiR標(biāo)記的細(xì)胞可分別使用常規(guī)FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3和FL4流式細(xì)胞儀檢測(cè)通道進(jìn)行分析。
參考文獻(xiàn)
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