定量分析晚期細(xì)胞凋亡中DNA片段的直接方法

多細(xì)胞生物是由高度組織化的細(xì)胞群落組成的，為了這個(gè)細(xì)胞群落的茁壯成長(zhǎng)，重要的是1.通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞增殖和凋亡，2.建立穩(wěn)態(tài)。這兩個(gè)過(guò)程中任何一個(gè)過(guò)程的不適當(dāng)轉(zhuǎn)變都會(huì)導(dǎo)致**。例如，神經(jīng)元凋亡活性的增加是各種神經(jīng)退行性**如阿爾茨海默氏癥和帕金森氏癥的根源。相反，凋亡機(jī)制的喪失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，這是細(xì)胞癌變的潛在機(jī)制?？偟膩?lái)說(shuō)，細(xì)胞凋亡在**中的作用是科學(xué)研究中的熱門(mén)話(huà)題。

細(xì)胞凋亡

圖1.概述了與細(xì)胞凋亡相關(guān)的所有參數(shù)。必須注意，這些事件不是按順序發(fā)生的。它們中的許多將重疊，并且常常同時(shí)發(fā)生。事件1到4是凋亡的生化特征，不一定以細(xì)胞死亡結(jié)束。下游凋亡事件5到8是細(xì)胞發(fā)生凋亡的有力標(biāo)志，此后細(xì)胞存活的可能性很小。

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的細(xì)胞程序性死亡途徑。這種細(xì)胞自主活動(dòng)過(guò)程的特點(diǎn)有幾個(gè)不同的形態(tài)和生化標(biāo)記，包括細(xì)胞和核收縮，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞質(zhì)膜泡和核DNA斷裂。這些形態(tài)學(xué)變化都源于兩種凋亡途徑：外源性或內(nèi)源性途徑。外源性途徑是由細(xì)胞外死亡受體配體（如腫瘤壞死因子（TNF）或Fas配體（FasL））激活的受體介導(dǎo)的途徑。內(nèi)源性途徑是由環(huán)境應(yīng)激引起的線(xiàn)粒體膜通透性和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和細(xì)胞色素c的釋放在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的。這兩種途徑的信號(hào)通過(guò)caspase級(jí)聯(lián)傳遞，*終導(dǎo)致caspase激活的核酸酶對(duì)細(xì)胞核DNA的下游消化。細(xì)胞凋亡的這些特征使得DNA片段分析能夠作為識(shí)別細(xì)胞凋亡的*終決定因素。

DNA片段的凋亡檢測(cè)

目前有各種各樣的技術(shù)可以用來(lái)來(lái)評(píng)估和鑒定凋亡DNA片段。*早的檢測(cè)方法是凝膠的DNA階梯分析法，使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)可視化和分離DNA片段。凋亡的DNA片段是一個(gè)獨(dú)特的“梯狀”模式的核體片段約180-200堿基對(duì)的長(zhǎng)度。雖然該技術(shù)在生成定性數(shù)據(jù)方面很有效，但不適應(yīng)高通量的應(yīng)用。

另一種檢測(cè)方法是用抗DNA和抗組蛋白抗體組成的雙抗體夾心ELSIA法來(lái)觀(guān)察細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA的斷裂。盡管這種檢測(cè)方法在檢測(cè)凋亡DNA片段方面更為敏感，并且易于高通量使用（例如復(fù)合篩選），但它需要長(zhǎng)時(shí)間手動(dòng)操作，并且抗體的使用比較昂貴。

TUNEL測(cè)定

1992年，Gorczyca等人引入了一種新的用于DNA片段凋亡檢測(cè)的方法，該方法利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和切口平移或TUNEL測(cè)定法測(cè)量凋亡性DNA片段化。TdT催化將熒光團(tuán)標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）添加到DNA雙鏈斷裂（DSB）的3'-羥基末端。

自從引入TUNEL檢測(cè)法以來(lái)，它已成為一種廣泛認(rèn)可的用于鑒定凋亡細(xì)胞死亡的原位技術(shù)。 與以前的方法相比，TUNEL測(cè)定具有更靈敏的能力，可以在幾個(gè)數(shù)量級(jí)上進(jìn)行廣泛的定量測(cè)量。 多年來(lái)，TUNEL技術(shù)已經(jīng)針對(duì)顯色和熒光檢測(cè)方法進(jìn)行了調(diào)整和優(yōu)化。 熒光TUNEL檢測(cè)利用與生物素偶聯(lián)的dUTP和酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素進(jìn)行高靈敏度染色。 熒光檢測(cè)方法依賴(lài)于熒光染料偶聯(lián)的dUTP，可直接檢測(cè)DNA片段。

影響TUNEL染色的因素有許多。其中一些變量包括試劑濃度、樣品固定和DNA鏈斷裂后的末端連接等，這些可能因組織或細(xì)胞樣品類(lèi)型而異。

Cell Meter TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

AAT Bioquest的Cell Meter TUNEL細(xì)胞凋亡測(cè)定法針對(duì)熒光檢測(cè)進(jìn)行了優(yōu)化，可用于綠色或紅色熒光發(fā)射。 AAT Bioquest的Cell Meter 檢測(cè)包括所有必需成分和實(shí)驗(yàn)方案，可以檢測(cè)和定量細(xì)胞中凋亡的DNA片段。 通過(guò)使用TdT將熒光染料修飾的脫氧尿苷5'-三磷酸核苷酸（Tunnelyte Green或Tunnelyte Red）催化并入DNA的3'OH末端，來(lái)檢測(cè)凋亡的DNA片段。 然后可以通過(guò)流式細(xì)胞儀定量標(biāo)記的DNA片段，或通過(guò)熒光顯微鏡直接觀(guān)察。

圖2.用誘導(dǎo)凋亡的化學(xué)物質(zhì)星形孢菌素（SS）處理HeLa細(xì)胞中TUNEL反應(yīng)的熒光圖像。 與未處理的對(duì)照相比，將HeLa細(xì)胞用100 nM或1μMSS處理4小時(shí)。 將細(xì)胞與反應(yīng)混合物在37oC下孵育1小時(shí)。 使用帶有FITC濾光片組的熒光顯微鏡分析綠色熒光信號(hào)。 熒光標(biāo)記的DNA鏈斷裂在SS處理的細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光。

Tunnelyte?綠色的497 nm峰值吸收非常適合通過(guò)配備488 nm氬離子激光線(xiàn)的儀器進(jìn)行有效激發(fā)。對(duì)于發(fā)射濾波片的選擇，可以分別使用FITC（530/30）或Cy5（660/40）濾波片讀取Tunnelyte?綠色或Tunnelyte?紅色。 由于Tunnelyte?核苷酸已與藍(lán)色光譜充分分離，因此DAPI，Hoechst或Nuclear Violet LCS1等染色劑適用于多色熒光應(yīng)用中的活細(xì)胞復(fù)染。

圖3.左：Tunnelyte Green的吸收和發(fā)射光譜。 激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm（藍(lán)色激發(fā)光線(xiàn)）。 帶有發(fā)射濾光片F(xiàn)ITC的Tunnelyte Green讀數(shù)（綠色波段）。右：Tunnelyte Red的吸收和發(fā)射光譜。 激發(fā)波長(zhǎng)為561 nm（綠色激發(fā)光線(xiàn)）。 帶有發(fā)射濾光片Cy5的Tunnelyte Red讀數(shù)（紅色波段）。

我們的Cell Meter TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒比其他市售TUNEL檢測(cè)試劑盒具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槲覀兊脑噭┖性诜磻?yīng)緩沖液中不含二甲基胂酸鈉或鉀。 不含二甲基胂酸鈉或鉀有兩個(gè)好處，首先，它要**得多。其次，它提供了更靈敏，準(zhǔn)確的凋亡檢測(cè)方法。二甲基胂酸鈉是一種致癌的砷衍生物，由于攝入，吸入或皮膚接觸而具有劇毒。由于毒性，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在測(cè)定中測(cè)量細(xì)胞凋亡時(shí)不可避免地會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)干擾。

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